定量ターゲットプロテオーム 解析技術

スマートセルプロジェクトでは、細胞が持つ物質生産能力を最大限に引き出すために、代謝経路の合理的な改変が求められる。代謝経路の改変では宿主微生物のゲノムを人為的に書き換え、酵素タンパク質存在量を増減させる。細胞内のタンパク質量には、転写、翻訳、タンパク質分解における様々な要因が関わるため、デザイン通り酵素タンパク質量が増減できたか迅速に評価する計測手法が必要となる。そこで、トリプシン消化ペプチド混合物を液体クロマトグラフで分離し、トリプル四重極型質量分析装置の選択反応モニタリングモード (Multiple Reaction Monitoring；MRMモード)で分析する高精度定量ターゲットプロテオミクス法が、スマートセルの評価に最適であることに注目した。現在、㈱島津製作所と共同で純国産ターゲットプロテオミクス分析システムの開発を進めている（図１）。

ターゲットプロテオミクス法の要点は、サンプル前処理法と定量用分析メソッド（MRMアッセイメソッド）の構築にある。まず、サンプル前処理として、50μgのトータルタンパク質を含む100 μL程度の粗タンパク質抽出液を出発点とした。これを還元アルキル化したのち、一晩トリプシン消化を行い、得られたトリプシン消化ペプチドを固相抽出法により脱塩する。この出芽酵母用の前処理法は、油脂酵母、大腸菌、コリネ菌といった様々な有用微生物において有効であった。

データ取得にはナノLC-MS/MS(LCMS^TM-8060 （株）島津製作所)を利用している。本システムは、1秒当たりのMRMチャンネル数を最大500まで増やすことができるため、定量プロテオーム解析用に適した性能を持つ。現在のシステムでは感度を重視して、ナノLCを採用し、1分析当たりの所要時間は1.5時間に設定することで、一般的な20～30サンプル程度の分析プロジェクトを2日程度で終了できるスループットを実現している。

MRMアッセイメソッドとは、測定対象タンパク質から生成する多数のトリプシン消化ペプチドから、LC-MSで高感度に検出可能な定量ペプチドを3～4種選抜し、さらに、各ペプチドに最適なMRM系列を4つ選抜したものである。MRMアッセイメソッドはタンパク質のアミノ酸配列に依存しているため、タンパク質ごとに作成する必要がある。MRMアッセイメソッド構築を効率化するには、探索するMRMを減らす必要がある。そこで、ペプチドの配列から定量に適したペプチドを予測する新たな手法を開発した。これは、従来法とは違う観点で、MRMアッセイメソッドに採用される見込みのない (Hopeless) ペプチドを探索する方法で、良いペプチドの見逃しを最小限としたまま、全体の3～4割のペプチドをHopelessとして取り除くことに成功した¹⁾。今後もMRMアッセイメソッド構築法の効率化を進めることが、迅速なMRMメソッドの作成、ひいては迅速なスマートセル開発につながると期待される。

これらの手法を用いて大腸菌、出芽酵母、コリネ菌、油脂酵母などの中心代謝酵素タンパク質のMRMアッセイメソッド作成が完了している。また作成したMRMアッセイメソッドは質量分析装置のメーカーが異なっても互換性があることが知られている。そこで、スマートセルプロジェクトで作成したMRMアッセイメソッドをデータベース化し、必要に応じてカスタマイズできる基盤構築を進めている(図２)。