コリネ菌を用いた有用芳香族化合物の生産性向上

実施機関

(公財)地球環境産業技術研究機構 (RITE)、（国研）理化学研究所、（国研）産業技術総合研究所、神戸大学、京都大学、大阪大学、東北大学、(株)日立製作所

研究開発のゴール

発酵生産困難な物質の高生産株を短期間で開発する。

目的

スマートセル設計技術を代表的な産業微生物であるコリネ菌に適用し、これまで発酵生産が困難だった物質の生産株を従来よりも短い期間で育種開発することを目指した。

RITEはこれまでにコリネ菌 (Corynebacterium glutamicum) を活用した発酵生産技術の開発を行ってきた^1-3)。C. glutamicumは非病原性、非運動性の土壌性グラム陽性桿菌で、グルタミン酸を培地中に排出する微生物として日本で発見された。RITEは独自にC. glutamicum R株を単離し、全ゲノム配列を決定している。今回、この菌を生産宿主とし、有用芳香族化合物の1つ(化合物A)を生産ターゲットとして生産株の開発を進めた。

化合物Aは電子部品製造の際に利用される他、医薬品原料、香料原料として大きな市場を有する。このように化合物Aは産業的な利用価値が高いものの、これまで生物を利用して高濃度生産された例はない。微生物全般に対して強い毒性を示すことと、糖からの代謝経路のステップ数が多く複雑なことがその原因だと考えられる。また、C. glutamicumは元々この化合物Aの生産経路を持たない。そこで、本プロジェクトにおいて複数のスマートセル設計技術を駆使することにより、高生産株の短期間育種を試みた。

結果・成果

土壌細菌であるC. glutamicumは化合物Aを分解し自身の栄養とすることができる。そこでまず化合物Aと、化合物Aの前駆体を分解する酵素遺伝子の破壊株を作製した。これを親株とし、化合物A生産に必要な遺伝子を導入しただけの生産株を作製した。スマートセル設計技術を利用せずに作製したこの株は極めて低濃度の化合物Aを生産した。

C. glutamicumで化合物Aを生産しうることがわかったもののその生産量は微量であったため、スマートセル設計技術の適用を試みた。「ハイスループット(HTP)トランスクリプトーム解析技術」、「高精度メタボローム解析技術」、「定量ターゲットプロテオーム解析技術」を活用することで遺伝子型の異なる複数の生産株から大量のデータを得た。これとゲノム情報を用い、「代謝経路設計技術」、「導入遺伝子配列設計技術」から複数の遺伝子改変提案を受けた。この提案には破壊すべき副生経路遺伝子、高発現させるべき生産経路遺伝子、新たに導入すべき外来遺伝子、発現量が増加する遺伝子配列等が含まれていた。これらの改変指針に基づきC. glutamicumの育種を進めたところ、化合物Aの生産性が大幅に向上した。その結果、過去に他グループから報告された生産濃度を上回り、世界最高の濃度に達した。現時点では生産株に未適用だが、「発現制御ネットワーク構築技術」、「文献等からの知識抽出・学習技術」、「輸送体探索技術」からの改変提案においても改善を示唆する予備検討結果を得ているため、さらなる生産性の向上が期待できる。また、特筆すべき点として、各スマートセル設計技術は併用可能であることが挙げられる。それぞれ代謝改変指針を導き出すアプローチが全く異なるため、生産株育種の過程で各技術からの改変提案を１つの生産株系列に積み重ねることが可能である。これにより下図に示したように野生株から順次生産性が大きく向上していく成果を得た。

以上のように、複数のスマートセル設計技術を活用することで生産困難なターゲット物質の1つである有用芳香族化合物Aの短期間での生産株構築と生産性の大幅な向上を達成した。

この研究で得られたデータ

プロジェクト（コリネ菌を用いた有用芳香族化合物の生産性向上による代謝解析技術の有効性検証）
　－ NITE生物資源データプラットフォーム(DBRP) から提供（制限公開データを含みます）